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吖啶橙(Acridine Orange，AO)屬于三環(huán)雜芳香燃料，可以標(biāo)記DNA、RNA，屬于異染性熒光染料。該染料具有膜通透性，能透過細(xì)胞膜，使核DNA和RNA染色。因此AO常用于細(xì)胞內(nèi)DNA和RNA進(jìn)行檢測。AO與核酸結(jié)合方式主要有：1、插入性結(jié)合，AO嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，這種結(jié)合方式主要為AO與DNA的結(jié)合，其熒光發(fā)射峰為530nm，激發(fā)后呈綠色熒光；2、靜電吸引，帶正電荷的AO與單鏈核酸的磷酸根(帶負(fù)電荷)產(chǎn)生靜電間的吸引結(jié)合，這種結(jié)合方式主要為AO與RNA的結(jié)合，其熒光發(fā)射峰為640nm，激發(fā)后呈紅色熒光，少量結(jié)合會呈桔黃色或桔紅色熒光。因此，吖啶橙嵌合到雙鏈DNA分子中顯綠色，與DNA單鏈或RNA結(jié)合時發(fā)桔黃色或橙紅色熒光。 

吖啶橙染色試劑盒(Acridine Orange Detection Kit)主要由AO Stain、AO Stain Buffer組成，常用于細(xì)胞凋亡的檢測。染色后在熒光顯微鏡下觀察，吖啶橙可透過正常細(xì)胞膜，使細(xì)胞核呈綠色或黃綠色均勻熒光；而在凋亡細(xì)胞中，因染色質(zhì)固縮或斷裂為大小不等的片斷，形成凋亡小體。吖啶橙使其染上致密濃染的黃綠色熒光或黃綠色碎片顆粒；而壞死細(xì)胞黃熒光減弱甚至消失。吖啶橙染色常與EB染色合用雙染，EB只染死細(xì)胞使之產(chǎn)生桔黃色熒光，由此可區(qū)分出正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞。

1、 熒光顯微鏡 

2、 低速離心機(jī) 

3、 PBS

4、 細(xì)胞計數(shù)板 

5、 載玻片、蓋玻片 

操作步驟(僅供參考)：

(一) AO單獨(dú)染色

1、 收集細(xì)胞(采用流式細(xì)胞儀檢測時，應(yīng)先固定細(xì)胞)，用AO Stain Buffer(1×)清洗細(xì)胞1次，加入適量的AO Stain Buffer(1×)重懸細(xì)胞，計數(shù)并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至106/ml。 

2、 取適量的細(xì)胞懸液和AO Stain，按照細(xì)胞懸液：AO Stain=19：1的比例混合，輕輕混勻。如果采用熒光顯微鏡下觀察，一般取95μl細(xì)胞懸液和5μl AO Stain混合即可。 

3、 室溫避光染色15min，滴加于載玻片上并加蓋玻片或上流式細(xì)胞儀分析。 

4、 熒光顯微鏡下觀察(激發(fā)濾光片波長488nm，阻斷濾光片波長515nm)，計數(shù)并拍照。 

染色結(jié)果：

正常細(xì)胞 

細(xì)胞被均勻染成黃綠色熒光 

凋亡細(xì)胞 

染色質(zhì)濃縮，細(xì)胞核碎裂成點(diǎn)狀，被染成大小不一、致密濃染的綠色顆粒 

(二) AO/EB雙染色 

1、 收集細(xì)胞，用AO Stain Buffer(1×)清洗細(xì)胞1次，加入適量的AO Stain Buffer(1×)重懸細(xì)胞，計數(shù)并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至106/ml。 

2、 取適量的細(xì)胞懸液和AO Stain，按照細(xì)胞懸液：AO Stain=19：1的比例混合，并加入適量EB染色液，輕輕混勻。如果采用熒光顯微鏡下觀察，一般取95μl細(xì)胞懸液和5μl AO Stain混合即可。 

3、 室溫避光染色15min，滴加于載玻片上并加蓋玻片 

4、 熒光顯微鏡濾光片515nm觀察，計數(shù)并拍照。 

染色結(jié)果：

正常細(xì)胞 

均勻染成綠色熒光 

壞死細(xì)胞 

細(xì)胞桔黃色熒光 

凋亡細(xì)胞 

染色質(zhì)濃縮，細(xì)胞核碎裂，被染成大小不一、致密濃染的黃綠色顆?；蛞姲|(zhì)芽狀突起。 

計算細(xì)胞凋亡率和死亡率:

細(xì)胞死亡率=凋亡細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù)×100%   細(xì)胞壞死率=壞死細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù)×100%

注意事項(xiàng)：

1． 吖啶橙染色常不EB染色合用，可區(qū)分出正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞。 

2． 如有低溫離心機(jī)進(jìn)行離心效果更佳，同時應(yīng)注意減少試劑暴露于強(qiáng)光下的時間。 

3． 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。